PROSEDUR PENYIAPAN PREPARAT

A. Membersihkan Alat

  1. Pipet yang masih baru

a)      Rebus pipet yang masih baru dalam larutan Na3PO4 1% selama 10 menit

b)      Cuci dengan air dengan bersih, kemudian keringkan.

c)      Rendam kembali dalam larutan HCL 1% untuk melarutkan lapisan fosfat pada gelasnya (selama 24 jam )

d)     Cuci dengan air hingga bersih kemudian dibilas dengan aquadest.

e)      Kerigkan dalam hot air sterilizer atau dengan sinar matahari. (jutono et al.1980)

2. Pipet yang sudah dipakai

a)      Pipet yang telah dipakai untuk mengambil mikroba harus didisinfektin dengan larutan fenol 5% atau disinfektan lain selama waktu tertentu.

b)      Keringkan seperlunya.

c)      Rebus dalam larutan Na3PO4 1% selama 10 menit.

d)     Cuci dengan air dan keringkan.

e)      Rendam dalam larutan HCL 1% untuk melarutkan fosfat  pada gelas selama 24 jam.

f)       Cuci dengan air bersih sampai bersih lalu bilas dengan aquadest.

g)      Keringkan dalam hot air stelizer atau dengan sinar matahari.(jutono et al; 1980)

  1. Gelas penutup yang masih baru

a)      Masukkann gelas penutup (cover glass) satu persatu dalam larutan alcohol asam beberapa jam.

b)      Buanglah larutan alcohol asamnya, lalu cuci gelas penutup satu persatu dengan air kemudian bilas dengan aquadest.

c)      Keringkan. (jutono et al. 1980)

  1. Gelas benda yang masih baru

a)      Redamlah gelas benda (object glass) yang masih baru dalam larutan alcohol yang asam (mengandung HCL 3%)selama beberapa jam.

b)      Cucilah dengan air lalu bilas dengan aquadest.

c)      Keringkan dengan menggosokkan dengan kain halus. (jutono et al 1980)

  1. Gelas benda dan gelas penutup yang telah dipakai

a)      Rebus gelas benda dan gelas penutup dalam larutan Na3PO4 1% selama 15 menit

b)      Cuci dengan air lalu redam dalam larutan HCL 1%

c)      Cuci dengan air lalu bilas dengan aquadest, kemudian keringkan. (jutono et al. 1980)

B. Sterilisasi

Sterilisasi adalah suatu usaha untuk membebaskan alat-alat atau bahan –bahan dari segala macam bentuk kehidupan, terutama mikroba. Sterilisasi alat-alat atau medium dapat dkerjakan secara mekanik (misalnya secara penyaringan),secara kimia (misalnya dengan disinfektan )ataupun cara fisik (misalnya dengan pemanasan sinar ultraviolet, sinar ). Cara sterilisasi yang dipakai tergantung pada macamnya bahan dan sifat bahan yang di sterilkan(ketahanan terhadap panas, bentuk bahan yang disterilkan;padat,cair atau gas). (jutono et al 1980)

  1. Sterilisasi dengan pemanasan
    1. Sterilisasi dengan pemijaran

Cara ini terutama dipakai  untuk sterilisasi jarum platina, ose dsb

yang terbuat dari platina atau nikrom. Caranya ialah dengan membakar alat-alat tersebut diatas api lampu spirtus sampai pijar.(jutono et al.1980).

  1. Sterilisasi dengan udara kering

Untuk keperluan ini dipakai alat yang disebut hot air stelizer. Alat ini dipakai untuk mensterilkan alat-alat gelas seperti Erlenmeyer, petridish, tabung reaksi dan alat-alat gelas yang lain. bahan-bahan seperti kapas,kain dan kertas jugaa dapat disterilkan dengan alat ini,tetapi dengan batas-batas tertentu. Pada umumnya temperature yang digunakan pada sterilisasi secara kering 170˚C – 180˚C selama paling sedikit 2 jam. Perlu  diperhatikan bahwa lamanya sterilisasi tergantung pada jumlah alat-alat yang disterilkan serta ketahanan alat terhadap panas.(jutono et al.1980)

  1. Sterilisasi dengan menggunakan uap air panas

Bahan-bahan yang mengandung cairan tidak dapat disterilkan dengan udara panas yang kering. Sterilisasinya yang baik adalah dengan menggunakan uap air panas. Bahan yang disterilkan dengan cara ini umumnya medium kultur yang tidak tahan terhadap panas yang tinggi.(jutono et al. 1980)

  1. Sterilisasi dengan menggunakan uap air panas bertekanan tinggi

Alat yang digunakan untuk sterilisasi uap air panas bertekanan adalah otoklaf (autoklaf).alat ini terdiri atas suatu bejana tahan tekanan tinggi yang dilengkapi dengan manometer, thermometer  dan klep bahaya. Sterlisasi yang paling baik jika dibandingkan dengan cara-cara sterilisasi  lainnya. Bahan atau alat-alat yang disterilkan ialah bahan-bahan atau alat-alat yang mudah rusak karena pemnasan dan tekanan tinggi.(jutono et al 1980)

  1. Sterilisasi dengan penyaringan.

bahan-bahan cair yang sangaat peka terhadap pemanasan (serum, darah, toksin)ataupun relative tidak taahan terhadap pemanasan tinggi(seperti medium yang mengandung senyawa-senyawa yang mengandung gula, dll). Tidak dapat disterilkan dengan cara pemanasan. Untuk keperluan ini diperlukan alat penyaring bakteri (barkerfeld filter, chamberland filter, seitz filter). (jutono et al 1980)

C. Teknik Pembuatan Preparat

  1. Fiksasi

Fiksasi merupakan langkah awal dalam pembuatan sediaan utuh maupun sediaan sayatan. (www.sift.itb.ac.id)’

Tujuan fiksasi

  1. Menghentikan proses metabolism secara cepat
  2. Mencegah kerusakan jaringan
  3. Mengawetkan komponen-komponen sitologis dan histologist.
  4. Mengawetkan keadaan sebenarnya.
  5. Mengeraskan, member materi-materi yang lembek akan menjadi koagolasi protoplasma dan maupun elemen-elemen didalam protoplasma.
  6. Jaringan dapat diwarna sehingga bagian-bagian dari jaringan dapat mudah dikenali. (www.sift.itb.ac.id).
  7. Beberapa macam fiksatif, ada yang bersifat umum maupun ada yang bersifat

khusus, yaitu:

  1. Larutan zanker

Fiksatif  zenker melarutkan elemen-elemen sitoplasma seperti albumen dan mitokondria. Komposisi :

  1. Potassium dikromat 2,5 gram.
  2. Merkuri khlorida 5gram.
  3. Aquadest 100cc.
  4. Sodium sulfat 1 gram.

Pada waktu akn digunakan tambahkan 1 cc asam asetat glacial.

  1. Formalin

Fiksatif yang digunakan sebagai pengawet umum. Jangan mencuci jaringan yang diawetkan didalam formalin karena akan menyebabkan timbulnya distorsi sebagai akibat dari membengkaknya jaringan/sampel. Komposisi:

  1. Formalin komersial 10cc
  2. Aquadest 90 cc.
  3. Larutan bauin

Merupakan fiksatif standar .komposisi:

  1. Larutan asam pikrat jenuh 75cc
  2. Formalin komersial.
  3. Asam asetat glacial 5cc.
  4. Larutan Gilson

Membunuh dan dapat masuk secara cepat kedalam jarngan tanpa menyebabkan menciutnya jaringan.komposisi:

  1. Merkuri khlorida jenuh 20 bagian (merkuri chloride 10gr, aquades 10cc).
  2. 1% larutan asam kromat 20 bagian.
  3. Asam nitrat 2 bagian.
  4. Asam glacial 2 bagian.
  5. Alcohol

Kurang baik untuk fiksatif karena sifatnya yang basa maka tidak dapat memfiksasi dengan baik khususnya inti. Alcohol juga akan melarutkan beberapa elemen sitoplasma. Karena alcohol cepat menguap, maka dapat menyebabkan jaringan mengkerut. Namun demikian alcohol baikuntuk memfiksasi jaringan saraf khususnya untuk memperlihatkan badan nissi.

Pengelompokkan fiksatif.

  1. Aldehida : formaldehida, glutaraldehida.
  2. Zat oksidatif : osmium tetraoksida, K- permanganat, K-dikromat.
  3. Zat mendenaturasi protein:asam cuka glacial, Met-OH, Et-OH.
  4. Zat yang belum atau tidak diketahui cara kerjanya: merkuri khlorida, asam pikrat.
  5. Reaksi fiksasi

Bila protein yang difiksasi adalah  protein terlarut, aka akan diikat dengan protein structural dan menjadi protein tidak terlarut. Setelah protein terlarut diikat dengan protein structural secara keseluruhan komponen protein akan menjadi kuat untuk perakuan-perlakuan mekanis berikutnya.

Factor yang berperan dalam memfiksasi:

  1. Buffer (pH)
  2. Suhu.
  3. Daya penetrasi: bila rendah maka potongan jaringan harus kecil/tipis.
  4. Perubahan volume.
  5. Osmolalitas larutan fiksatif
  6. Penambahan detergen agar fiksatif mudah masuk.
  7. Konsentrasi
  8. Waktu fiksasi : tergantung sifat jaringan dan sifat fiksatif, serta ukuran jaringan.
  9. Dehidrasi (dehydration)

Tujuan : menghilangkan air dan jaringan/ sel. Bahan yang digunakan untuk dehidrasi:

  1. Etanol (Et-OH)
  2. Methanol (Mt-OH)
  3. Butanol (Bu-OH)
  4. Penjernihan (clearing).

Clearing merupakan tahap perantara bila menggunakan paraffin sebagai media tanam. Syarat sebagai suatu clearing agent:

  1. Dapat menggantikan etanol dengan cepat.
  2. Dapat melarutkan media infiltrasi dengan mudah.
  3. Tidak menggangu tahap jaringan.

Agensia yang baik sebagai suatu agen penjernih (clering agent):

  1. Xilol
  2. Toloul
  3. Benzena
  4. Armil asetat
  5. Cedarwood oil
  6. Minyak cengkeh